IDENTIFIKASI MIKROBA METODE PEWARNAAN GRAM

Assalamu'alaikum warahmatullahi wabarakatuh. Pada kesempatan kali ini, saya akan ngajak kalian untuk berkenalan dengan salah satu metode yang digunakan dalam identifikasi mikroba yaitu metode pewarnaan Gram. Nah, kalian pasti penasaran kan tentang  pewarnaan Gram  itu apa ?

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah  salah satu teknik pewarnaan yang ditemukan oleh seorang ilmuwan Denmark Hans Christian Gram untuk mengidentifikasi suatu bakteri baik bakteri gram negatif maupun bakteri gram positif berdasarkan warna yang akan diserap dengan menggunakan bahan kimia seperti  larutan kristal violet, larutan iodium, larutan alkohol, dan larutan safranin. Secara  simplenya sih pewarnaaan gram yaitu pemberian warna utama dengan kristal violet, untuk memperkuat warna ditambahkan iodin, dilakukan pencucian (dekalorisasi) dengan alkohol, dan pemberian warna sekunder dengan safranin. Metode perwarnaan gram berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologi sel seperti reaksi dinding sel dan tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya). Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi pewarnaan Gram yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan danpenggunaan zat warna penutup.

Secara spesifik tentang larutan-larutan yang digunakan dalam pewarnaan Gram.

1.      Kristal violet

Kristal violet merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna sel mikroorganisme. Kristal violet tersusun atas Kristal violet, etil alkohol, ammonium oksalat. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu). Kristal violet berbentuk cair, berwarna ungu, dan berbau alkohol.

2.      Iodin

Pewarnaan iodin berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap sel bakteri. Pemberian iodin pada perwarnaan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri.Iodin tersusun atas kalium iodin dan iodium. Iodin berbentuk cair, berwarna cokelat gelap dan hampir tidak berbau.

3.      Safranin

Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, memberikan warna kedua pada sel mikroorganisme.Safranin tersusun atas safranin O, etil alkohol dan aquades. Safranin berbentuk cair, berwarna merah dan berbau tajam.

4.      Alkohol

Alkohol yang berfungsi untuk dekolorisasi yaitu membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel mikroorganisme. Alkohol merupakan senyawa yang tersusun atas karbon, oksigen dan hydrogen. Alkohol berbentuk cair, tak berwarna, dan berbau. Pemberian alkohol (dekolorisasi)pada pewarnaan bakteri gram positif dan bakteri gram negatifini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme  akan tetap berwarna ungu untuk bakteri gram positif, danbakteri menjadi tidak berwarna atau berwarna merah pada bakteri gram negatif.

Terus bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif itu apa sih ?

Gambar a) Bakteri Gram Positif
b) Bakteri Gram Negatif

Bakteri Gram positif itu adalah bakteri yang memiliki dinding sel yang dapat mempertahankan zat warna Kristal violet karena mengandung lebih banyak peptidoglikan. Nah ciri-ciri bakteri gram positif yaitu memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal. Bakteri Gram positif memiliki peptidoglikan setebal 15-80 nm dengan komposisi terbesar teichoic, asam teichuroni dan berbagai macam polisakarida. Memiliki bentuk sel bulat, batang atau filamen, cara reproduksinya dengan pembelahan biner, serta memiliki alat gerak yang kebanyakan nonmotil. Bakteri Gram positif akan berwarna ungu atau biru gelap saat diamati dengan mikroskop. Contoh dari bakteri gram positif  itu sendiri ialah Clostridium tetani, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Streptococcus pnemoniae.

Sedangkan bakteri gram negatif  merupakan  bakteri yang tidak dapat mempertahankan warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram sehingga akan berwarna merah muda bila diamati dengan mikroskop. Ciri-ciri bakteri Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis (5-10 nm) dengan komposisi utama berupa lipoprotein, membran luar, dan lipopolisakarida. Bersifat pathogen, membran luarnya dapat melindungi bakteri dari sistem pertahanan inang dan menghalangi masuknya obat-obatan antibiotic serta senyawa lipopolisakaridanya bersifat toksik bagi inangnya. Contoh bakteri gram negatif ialah Aeruginosa, Azotobacter, Influenza, Rhizobium leguminosarum, Salmonella typhi, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrchoeae, Pseudomonas aeruginosa.

So, bagaimana cara mengidentifikasi mikroba dengan menggunakan metode pewarnaan Gram ?

      Cara mengidentifikasi mikroba metode pewarnaan gram yaitu meja kerja disterilkan saat melakukan praktikum dengan menggunakan alkohol begitu juga dengan alat yang akan digunakan, lalu dilakukan pemasangan bunsen dengan tabung gas, setelah itu bunsen dinyalakan dengan api sedang. Kemudian kaca preparat difiksasi. Fiksasi bertujuan untuk melekatkan struktur sel mikroba pada kaca preparat agar tidak mengalami perubahan bentuk dan ukuran. Setelah difiksasi biarkan preparat dingin. Kemudian bakteri Lactobacillus casei diambil dan digoreskan ke kaca preparat secukupnya menggunakan ose bundar. Setelah itu, kaca preparat yang telah terisi bakteri difiksasi kembali. Kemudian diberikan Kristal violet dan dibiarkan ± 1 menit. Setelah itu, dibilas dengan aquades. Lalu ditambahkan iodin dan dibiarkan ± 30 detik. Kemudian dibilas kembali dengan aquades, lalu diberikan alkohol. Kemudian dibilas kembali dengan aquades. Lalu, diberikan safranin dan tunggu beberapa detik kemudian dibilas kembali dengan aquades. Setelah itu, ditutup dengan objek glass diatas permukaan preparat. Terakhir, preparat diamati di bawah mikroskop cahaya.